Технология цифровой сегментации изображений интерфазных ядер

Изучение интерфазного хроматина в большинстве случаев затруднено отсутствием методов быстрой оценки его состояния в условиях скорости и динамики происходящих в нем процессов. Как правило, методы анализа интерфазного хроматина основаны на тонком молекулярно-генетическом исследовании, при котором изучаемая клетка фиксируется. При этом зачастую меняется химическая структура хроматина, может деформироваться и ядро клетки. В условиях фиксации архитектоника хроматина сохраняется, но исчезает возможность динамического наблюдения процессов, происходящих в ядре. Для анализа динамического изменения состояния интерфазного хроматина нами предложена модель его компьютерной сегментации по оптической плотности. Сегментация ядра недоступна нашему глазу при изучении клеток в оптических системах, но это можно сделать с помощью цифровой обработки изображений. При анализе денситометрических показателей интерфазных ядер тестовых объектов получаются сегментированные изображения ядер клеток с известными математическими параметрами, с помощью которых можно описать морфофункциональные характеристики клеток.

Обработка изображений — любая форма обработки информации, для которой входные данные представлены изображением, например, фотографиями или видеокадрами. Обработка изображений может осуществляться, как для получения изображения на выходе (например, подготовка к полиграфическому тиражированию, к телетрансляции и т. д.), так и для получения другой информации (например, распознавание текста, подсчёт числа и типов клеток в поле микроскопа и т. д.). Кроме статичных двумерных изображений, обрабатывать требуется также изображения, изменяющиеся со временем, например видео. Ещё в середине XX века обработка изображений была по большей части аналоговой и выполнялась оптическими устройствами. Подобные оптические методы до сих пор важны, в таких областях как, например, голография. Тем не менее, с резким ростом производительности компьютеров, эти методы всё в большей мере вытеснялись методами цифровой обработки изображений. Методы цифровой обработки изображений обычно являются более точными, надёжными, гибкими и простыми в реализации, нежели аналоговые методы. В цифровой обработке изображений широко применяется специализированное оборудование, такое, как процессоры с конвейерной обработкой инструкций и многопроцессорные системы. В особенной мере это касается систем обработки видео. Обработка изображений выполняется также с помощью программных средств компьютерной математики, например, MATLAB, Mathcad, Maple, Mathematica и др. Для этого в них используются как базовые средства, так и пакеты расширения ImageProcessing.

Основными характеристика для описания морфофункционального состоняния интерфазного хроматина были предложены следующие:

• Площадь ядра и относительная площадь сегмента
Interest Only Personal Loans
• Координаты центра ядра
• Величина периметра ядра
• Отношение диаметров (максимального к минимальному)
• Максимальная, минимальная, суммарная и средняя (медиана) плотность
• Коэффициент подобия кругу
• Относительная плотность
• Среднее значение (медиана) относительной плотности и распределение
• Относительное расстояние между центрами сегментов (максимальное, минимальное, среднее, медиана)
• Количество сегментов
• Положение сегмента (координаты) с максимальной относительной плотностью относительно центра ядра
• Соотношение площадей сегментов с близкой плотностью при разных методах сегментации

Относительная площадь сегмента — это отношение площади сегмента к максимальной площади (площадь ядра) для метода сегментации при определенном заданном уровне сегментации.

Коэффициент плотности хроматина — величина вычисляется как отношение значения интенсивности для каждой сегментированной области к максимальному значению интенсивности. Данная величина характеризует анизотропию хроматина, чем выше ее значение, тем ниже анизотропия, тем хроматин менее плотный (более рыхлый) в данной области ядра.

Относительное расстояние между центрами сегментов — это отношение медианы расстояний между центрами сегментов к максимальному значению расстояний для метода сегментации при определенном заданном уровне сегментации.

В практической реализации было проведено сравнение показателей метода для различных типов клеток и при действии факторов активации и репрессии. Так оказалось, что при сравнении плотностей сегментированных ядер клеток обнаружена достоверная разница между клетками HL60 и Т-лимфоцитами, как для фракции CD4+, так и для СD8+ лимфоцитов. Количество областей сегментации при этом было одинаковым и статистически не отличалось для всех изучаемых типов клеток. При сравнении плотности между фракциями Т-лимфоцитов не наблюдалось отличий.

Описанные результаты могут свидетельствовать о том, что в клетках линии HL60 хроматин представлен менее плотными фракциями, имеет более рыхлую структуру по-сравнению с Т-лимфоцитами. Известно, что клетки линии HL60 имеют миелобластную морфологию, это крупные бластные клетки с большим, круглым ядром с 2–4 ядрышками. Цитогенетический анализ клеток линии HL60 показывает наличие большого числа кариотипических аномалий, таких как: моносомии, трисомии и тетрасомии, множества хромосомных транслокаций. Т-лимфоциты являются дифференцированными клетками, хроматин таких клеток более специализирован под выполняемые задачи, большая его часть является гетерохроматином.

При этом цифровая обработка изображений ядер позволила установить заметное отличие некоторых показателей ядер Т-лимфоцитов обеих фракций по сравнению с ядрами клеток линии HL60. Это может свидетельствовать о более упорядоченной и консервативной структуре ядер Т-лимфоцитов по сравнению с ядрами HL60.

Как было показано в последние годы, наночастицы оказывают множественные воздействия на клетку. В зависимости от концентрации и размера, а также от типа наночастиц, они могут вызывать клеточную гибель, активацию хроматина или его повреждение (генотоксичность).

При изучении динамических изменений интерфазного хроматина в ядрах лимфоцитов после действия наночастиц серебра (диаметр 9 нм, концентрация 1,35 мкг/мл) было обнаружено изменение плотности хроматина со временем, в результате такого воздействия клетки погибали.

При действии различных факторов активации и угнетения (ФГА, преднизолон и т.п.) на лимфоциты было выявлено, что количественные характеристики сегментированных ядер достоверно чувствительны к таким воздействиям и позволяют изучать ход и последствия таких воздействий.

Полученные при этом выводы проверялись с помощью референтного анализа (метод FISH), который показал, что действие различных факторов на лимфоциты сопровождается изменением положения отдельных структур хромосом относительно центра ядра.

Время, мин	Исходное изображение	Изображение с сегментированными ядрами
0 мин
15 мин
20 мин
25 мин
30 мин

Рисунок 1. Обработка изображений ядер Т-лимфоцитов после воздействия наночастиц серебра. Стрелкой указан эритроцит.