Фазовая микроскопия

Для анализа морфофункционального статуса клеток — поверхностной архитектоники, рецепторного аппарата и функции — существуют различные автоматизированные методы. В основном исследуются фиксированные и окрашенные клетки, что требует применения дорогостоящих реактивов и аппаратуры, значительных временных затрат, может приводить к искажению или потере информации. Поэтому для решения вопросов патогенеза, диагностики, оценки тяжести патологических процессов и эффективности проводимой терапии актуальны новые технологии, позволяющие оперативно в реальном времени производить количественный анализ показателей структуры и функции клеток без фиксации и контрастирования изображения.

Современные лазерные интерферометры высокочувствительны, их важное свойство — возможность без разрушения объекта проводить измерения вдоль определенной оси с точностью до десятых долей нанометра. Данные оптические системы являются мощным универсальным инструментом диагностики и относятся к разряду новых технологий.

В 1995 году создание нового интерференционного прибора было инициировано Министерством здравоохранения Российской Федерации в рамках темы «Разработка компьютерного лазерного микроскопа для прижизненного анализа морфофункционального состояния цитообъектов».

Авторским коллективом разработана и реализована оригинальная технология витальной компьютерной фазометрии (КФМ) клеток крови, включающая способы пробоподготовки, компьютерную систему анализа изображений, алгоритмы измерений и идентификации фазовых клеточных портретов, статистическую обработку данных. КФМ отвечает требованиям оперативности, малой инвазивности, позволяет стандартизировать и упростить процедуру получения необходимой информации.

Алгоритм анализа оптико-геометрических параметров фазовых изображений живых клеток крови в режиме реального времени включает:

• структурно-объемные показатели отдельных клеток (топограмма в псевдоцвете, 3х-мерное изображение, оптический профиль, гистограмма распределения фазовых высот) — I уровень;

Структурно-объемные показатели отдельных клеток (Рис. 1)

• расчет фазометрических показателей отдельных клеток (диаметр, периметр, высота, площадь, объем); оценку распределения объема и площади клетки по уровням сканирования (характеристика адгезивности); контурное изображение топографии интерференционного поля клетки (послойная интерферограмма в псевдоцвете) — II уровень;
• интегральный морфометрический анализ клеточной популяции по оптико-геометрическим показателям (диаметр, периметр, высота, площадь, объем), построение цитограмм — III уровень;

С помощью КФМ получена и количественно оценена новая информация о пространственно-временном статусе различных цитообъектов (микрогеометрии поверхности, толщине слоев, показателе преломления). Установлено, что характерные локальные трансформации фазового рельефа клетки отражают динамику ядерных структур, наличие внутриклеточных органелл, включений с различной степенью анизотропии. Важную роль играют особенности химического состава, концентрации и агрегатного состояния вещества клетки. Таким образом, фазовые портреты живых цитообъектов свидетельствуют об особенностях их морфологии, отражают состояние клеточного гомеостаза, определяющего уровень взаимоотношений энергетики, трофики и функциональной активности, т.е. ее структурно-метаболическую организацию.

Идентифицированы и охарактеризованы витальные фазовые портреты всех клеток крови: эритроцитов, нейтрофилов, моноцитов, Т- и В-лимфоцитов, тромбоцитов. В рамках одного метода оценены особенности их морфологии, размерные показатели, функциональная активность. Выявлены и количественно оценены закономерности изменения морфофункционального состояния клеток крови в норме (с учетом возрастных особенностей) и при различных патологических состояниях. На основании изданных методических рекомендаций и пособий для врачей КФМ используется в медицинской практике для диагностики (в том числе доклинической), оценки тяжести и прогноза патологического процесса, анализа эффективности терапии.

Трансплантология. Разработан алгоритм экспресс-тестирования иммунологической реактивности пациента для ранней диагностики и прогнозирования угрозы развития кризов отторжения аллотрансплантата.

(«Компьютерная морфометрия лимфоцитов в диагностике ранних кризов отторжения ренального аллотрансплантата». Учебное пособие: Москва, ООО «Вега-сервис», 2009. — 20 с.; патент РФ «Способ диагностики отторжения почечного аллотрансплантата» №2348932, 2009; патент РФ «Способ диагностики отторжения почечного аллотрансплантата» №2009139822, 2011).

Разработана методика оценки витального морфофункционального состояния эритроцитов, позволяющая в условиях in situ получать качественно новую информацию о состоянии эритрона у больных с хронической почечной недостаточностью (ХПН) при лечении рекомбинантным эритропоэтином.

(«Применение эпрекса (Эпоэтин-альфа) при анемии у больных с терминальной стадией хронической почечной недостаточности». Учебное пособие. М.:МОНИКИ, 1999. — 23 с.; «Лечение анемии у больных терминальной стадией хронической почечечной недостаточности». Учебное пособие. М.:МОНИКИ, 2005. — 37с.).

Анестезиология и реаниматология. Витальные морфометрические показатели тромбоцитов используются в качестве чувствительных индикаторов тяжести состояния больных с гнойно-септическими осложнениями заболеваний органов брюшной полости и синдромом полиорганной недостаточности, позволяют определять индивидуальную чувствительность пациента на операцию полупродленнойгемофильтрации, регулировать оптимальную длительность лечебных процедур.

(Патент РФ «Способ прогнозирования течения полиорганной недостаточности» № 2377566; 2009; «Высокообъемная гемофильтрация у хирургических больных с тяжелым эндотоксикозом» Пособие для врачей. М., 2009. — 11 с.)

Челюстно-лицевая хирургия. Комплекс морфометрических показателей живых нейтрофилов крови позволяет оценить уровень неспецифической резистентности и резервные возможности организма, эффективность лечебных мероприятий, ускоряющих репаративные процессы у больных с абсцессами и флегмонами лица и шеи, прогнозировать вероятность развития гнойно-воспалительных осложнений.

(«Лечение больных с гнойно-некротическими процессами челюстно-лицевой области с применением фотофореза лекарственных препаратов и салфеток «Колетекс». Пособие для врачей. М., 2005. — 37 с.; патент РФ «Способ прогнозирования гнойно-воспалительных осложнений у больных с травмами челюстно-лицевой области» № 2317832, 2008.)

Оториноларингология. На основании результатов КФМ Т- и В-лимфоцитов периферической крови больных респираторным папилломатозом (РП) выявляют уровень их морфофункциональных нарушений, соответствующих фазе развития РП, оценивают эффективность лечения иммуномодулятором Пирогеналом.

Пульмонология. Разработан способ экспресс-определения чувствительности клеток-участниц воспалительного процесса (мононуклеарных фагоцитов) к стероидам у больных с бронхиальной астмой и саркоидозом, разработаны прогностические критерии эффективности глюкокортикостероидной терапии.

(Патент РФ «Способ прогнозирования эффективности лечения глюкокортикостероидами» № 2382364, 2009)

Дерматология. Впервые в режиме реального времени на основе анализа оптико-геометрических параметров установлена возможность идентификации по особенностям строения (церибреформное ядро) атипичных форм живых нативных лимфоцитов (клеток Сезари) — критерия диагностики и оценки прогноза течения эритродермических вариантов Т-клеточных злокачественных лимфом кожи.

Акушерство и гинекология. КФМ лимфоцитов и моноцитов используют для диагностики, оценки эффективности лечебных и реабилитационных мероприятий, прогнозирования рецидива внутреннего (аденомиоза) и наружного эндометриоза.

(«Прижизненная компьютерная лазерная фазометрия в изучении иммуноморфологических признаков глубокого инфильтративного эндометриоза». Л.В.Адамян, С.А.Гаспарян, И.А.Василенко. // «Генитальный эндометриоз: современный взгляд на проблему», Ставрополь, 2004; — С.113-123.)

КФМ тромбоцитов применяется как скрининговый экспресс-метод при комплексном обследовании беременных группы риска (ранняя диагностика неразвивающейся беременности, привычного выкидыша, антифосфолипидного синдрома, гестоза и др.); для контроля эффективности антикоагулянтной терапии.

Онкология. КФМ тромбоцитов используют для оценки угрозы тромботических осложнений у пациентов со злокачественными новообразованиями на фоне лучевой и химиотерапии.

КФМ эритроцитов и тромбоцитов используют для оценки адекватности и эффективности внутривенного лазерного облучения крови пациентам со злокачественными новообразованиями основных локализаций.

(Патент РФ «Способ лечения онкологических больных» № 2317832, 2008; «Методика системного низкоинтенсивного лазерного воздействия в качестве радиомодификатора при лучевой терапии злокачественных опухолей». Пособие для врачей. М., 2009. — 11 с.)

При диагностике предопухолевых состояний и опухолей молочной железы исследуют интенсивность и спектральные характеристики флуктуаций фазовой толщины ядрышек клеток в частотном диапазоне 0,8 — 20 Гц для повышения точности и достоверности выявления раковых клеток.

(«Цитологическая диагностика рака с применением когерентной фазовой микроскопии». Медицинская технология. М., 2009. — 12 с.)

Внедрение технологии КФМ в медицинских учреждениях Москвы (Российский университет дружбы народов, Центр акушерства, гинекологии и перинатологии им. В.И. Кулакова, Гематологический научный центр, Московский научно-исследовательский онкологический институт им. П.А. Герцена, Онкологический научный центр, Российская медицинская академия последипломного образования, Научно-исследовательский институт ревматологии, Московский областной научно-исследовательский клинический институт им. М.Ф. Владимирского) и других городов России (Красноярск, Ставрополь, Кисловодск, Пятигорск и др.) позволило повысить качество диагностики, эффективность лечебных мероприятий, снизить стоимость диагностических исследований и сроки пребывания в стационаре на 10–25%. Только эконономический эффект на каждый сохраненный трансплантат почки составил не менее 800 тыс. руб.

Результаты исследований опубликованы в 150 печатных работах в отечественных и зарубежных журналах, доложены и обсуждены на 60 Российских и международных научных форумах. Защищено 30 кандидатских и докторских диссертационных работ.

Перспективы научных исследований состоят в дальнейшем развитии и совершенствовании технической базы и методологических приемов витальной компьютерной фазовой микроскопии клеток крови для активного внедрения в практическое здравоохранение, создание витальной клеточной интерференционной голографии и томографии.